Saturated-mutagenesis-library-NNK：饱和突变文库 oligo 设计脚本

这个脚本解决什么问题

做蛋白质定向进化时，饱和突变（saturation mutagenesis）文库的 oligo 设计是件繁琐的体力活：野生型序列要切成合适长度的片段、每段之间留足重叠区、每个氨基酸位点要生成 19 个突变体（跳过野生型本身）、密码子还要按宿主优化——手工在 Excel 里排又容易出错。

这个 Python 脚本把整条流程自动化了：输入野生型 DNA 序列和上下游引物，直接输出一份可用于合成的 oligo 清单（CSV）。

核心功能

• 片段化：默认按 300 bp 目标长度切分野生型序列，相邻片段保留 60 bp 重叠区（两端各 30 bp 安全区）
• 饱和突变：对每个氨基酸位点（起始密码子除外）生成 19 种突变，密码子采用 E. coli 优化
• 安全区保护：重叠区内的序列保持野生型，不引入突变，保证下游 Gibson 等组装方法的兼容性
• 引物整合：上下游 PCR 引物自动并入首尾片段
• 输入校验：只允许 A/T/C/G，序列长度必须是 3 的倍数
• 覆盖率报告：控制台输出每个片段的切片位置、突变位点范围，并对未覆盖位点或超长 oligo 给出警告

使用示例

python Saturation_mutation_NNK_v1.py \
  --wt_DNA <野生型DNA序列> \
  --output s9_NNK_oligo.csv

主要参数：

参数	说明	默认值
--wt_DNA	野生型 DNA 序列（必填）	—
--up_primer	上游引物	ACAATTCTGCCTAGGAGATCT
--down_primer	下游引物	TGACATCTGtagtgcaACAAG
--oligo_len	oligo 目标长度（bp）	300
--safe_len	片段两端安全区长度（重叠 = 2 × safe_len）	30

一次典型运行的输出：

Fragment 1: slice [0:279], length 279, mutated aa 2 to 83
Fragment 2: slice [219:519], length 300, mutated aa 84 to 163
...
All amino acid positions (except start codon) covered.
Generated 8588 oligos. Saved to s9_NNK_oligo.csv

相比全 20 氨基酸饱和的优势

只生成 19 个突变体（排除野生型氨基酸）而不是 20 个，能显著降低 oligo 总量——对大基因的文库来说，合成的成本差距相当可观。

环境要求

Python 3.6+，只用标准库（csv / math / argparse），无需额外安装依赖。

相关链接

• GitHub：Caizhaohui/Saturated-mutagenesis-library-NNK